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含有可改变蛋白含量的分子诱导物的转基因植物

含有可改变蛋白含量的分子诱导物的转基因植物

本申请描述含Nic基因产物反应性元件的分离核酸,及其以下用途,用于生产降低水平烟碱和/或TSNA的转基因烟草植物、以及所含相关蛋白水平改变的其它植物或宿主细胞的方法,这是由于其中包括顺式作用诱饵元件。

同样,以下顺式元件的类似串联阵列转化植物,以降低对应反式作用DNA结合因子的结合活性:AATT顺式作用重复元件及其对应PABF反式作用因子(见美国专利5,834,236和6,191,258);poly(dA-dT)正调节元件及结合蛋白和CCAA重复负调节元件及结合蛋白(Wang等(1992)Mol.Cell Biol.12:3399-3406);来自烟草光敏色素A1启动子的根尖调节元件(Adam等(1995)Plant Mo1.Biol.29:983-993);来自玉米3-磷酸甘油醛脱氢酶4基因的无氧反应元件(Geffers等(2000)Plant Mol.Biol.43:11-21);和来自拟南荠油质蛋白基因的种子特异性调节区(见美国专利5,792,922)。

附图简述图1描述导致烟碱生物合成的生物合成途径。已知通过Nic1和Nic2调节的酶活性是QPTase(喹啉酸磷酸核糖转移酶)和PMTase(腐胺甲基转移酶)。在烟碱生物合成中QPTase和PMTase是限速酶催化步骤,烟碱水平与QPTase和PMTase活性成正比。

本发明进一步的方面是制造低烟碱含量和/或烟草特异性亚硝胺(TSNA)的转基因烟草植物的方法。该方法包括将含如上述Nic基因产物反应元件的外源核酸构造物导入所述至少一个烟草植物细胞,以产生至少一个转化烟草植物细胞。与缺少该外源核酸植物中的烟碱和/或TSNA水平相比,这至少一个转化烟草植物细胞包含外源核酸的量或拷贝数足以降低由该细胞或这些细胞再生的烟草植物中烟碱和/或TSNA水平。该方法可进一步包括由转化植物细胞产生烟草植物,以及(可选的)收集该烟草植物的烟叶、茎或种子。因而,由所述方法产生的烟草植物,包括其叶、茎和种子,也是本发明的内容。

因为QPTase和PMTase活性与烟碱含量紧密相关,如上述,植物根部QPTase或PMTase水平降低(与野生型植物中的水平相比)的转基因烟草植物的构造导致烟碱水平降低的植物。不需联系任何专门理论,预期创建烟碱量降低的烟草植物、烟草和烟草产品也将导致TSNA量降低。也就是说,通过去除烟草植物、烟草和烟草产品中的烟碱,可以有效去除形成TSNA的生物碱来源。

在本发明的一些优选实施方案中,为帮助确保有足够数量的诱饵或顺式作用元件插入细胞并在很多细胞分裂中保持以产生其中蛋白水平改变的转基因植物,使用上述轰击转化方法,用环状DNA或质粒携带上述顺式作用诱饵片段,所用环状DNA或质粒相对较小(例如由少于10,000或6,000碱基对组成),与选择标记相比,高摩尔比的顺式作用元件(例如10∶1)被插入宿主细胞。

本发明描述一种生产转基因植物,如转基因烟草的方法,这种植物的蛋白含量被改变,从而导致表型改变,如烟碱水平降低,以及照此产生的转基因植物和这种植物的种子。

可用于将本发明核酸构造物转化植物组织的载体包括轰击型载体(ballistic vectors)和农杆菌载体,以及适于DNA介导转化的载体。这些在下面将详细讨论。

本发明进一步的方面是烟碱和/或TSNA水平降低的烟草植物,该植物含有含外源核酸的细胞,该外源核酸含有上述Nic基因产物反应元件。与缺少该外源核酸的植物中的烟碱水平相比,该外源核酸包含在细胞中的拷贝数足以降低该烟草植物的烟碱水平。另外,该植物的叶、茎和种子,也是本发明的内容。

已经分离出QPTase cDNA和基因组克隆(NtQPT1),NtQPT1的转录水平也受Nic1和Nic2调节(Song,W.,Mendu,N.,and Conkling,M.A..(1999)Plant Cell,待发表)。因此这显示,Nic基因通过调节编码两个限速酶PMTase和QPTase基因的转录水平,从而调节烟碱含量。进一步显示,Nic1和Nic2是NtQPT1转录的正调节子,其转录起始位点上游的启动子序列包含NtQPT1转录Nic基因产物活化必需的顺式作用序列。因为QPTase和PMTase表达受Nic基因产物的共同调节,可能Nic基因产物也直接调节PMT基因转录。

实施例4用TGACG分子诱饵调节ASF-1结合核苷酸序列TGACG以串联阵列插入植物-农杆菌穿梭载体,并通过本领域已知的方法转化入植物,如豌豆。稳定转化所述载体的植物中反式作用DNA结合因子ASF-1的结合活性降低,它识别序列基序TGACG,该基序在植物基因中发现,如组蛋白基因(Mikami等,(1987)FEBS Lett.223:273);负责农杆碱生物合成的酶基因(Velten等,EMBOJ.3:2723-30);章鱼肉碱合酶基因(Ellis等,EMBO J.6:3203);和甘露碱合酶基因(DeRita和Gelvin,(1987)Mo1.Gen.Genet.207:233);以及CaMV35S基因、组蛋白H3基因和胭脂碱合酶基因。

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